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創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是全球死亡的重要原因，給全球經(jīng)濟(jì)和公共健康帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。機(jī)械撞擊會(huì)迅速破壞大腦結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致 TBI 的發(fā)作。原發(fā)性損傷直接損害神經(jīng)元、血管和血腦屏障 （BBB）。然后，細(xì)胞和分子事件的復(fù)雜和持續(xù)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括線(xiàn)粒體損傷、炎癥因子和氧化應(yīng)激形成等，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，從而導(dǎo)致進(jìn)一步的神經(jīng)元凋亡、壞死和功能障礙。此外，損傷會(huì)激活免疫細(xì)胞并將外周免疫細(xì)胞募集到損傷部位。活化的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化向 M1 促炎表型，并進(jìn)一步分泌促炎因子，引起長(zhǎng)期的炎癥反應(yīng)，這會(huì)抑制新神經(jīng)元的整合并阻礙軸突發(fā)育。因此，TBI 后快速神經(jīng)保護(hù)和減少慢性神經(jīng)炎癥對(duì)于最大限度地減少損傷程度和促進(jìn)神經(jīng)元再生至關(guān)重要。

基于此，暨南大學(xué)郭瑞研究員和軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所副所長(zhǎng)、軍事醫(yī)學(xué)研究院組織工程研究中心主任王常勇教授研究開(kāi)發(fā)了載有 EPO 和 MSN@IL-4 （GC/I/E） 的明膠-甲基丙烯酰 （GelMA）/殼聚糖-甲基丙烯酰 （CSMA） 光交聯(lián)水凝膠，以實(shí)現(xiàn) EPO 的快速釋放和 IL-4 的緩慢釋放?？勺⑸?GC 水凝膠具有低溶脹性能，適應(yīng)大腦的機(jī)械強(qiáng)度，延長(zhǎng)降解時(shí)間，為神經(jīng)再生提供有效的物理支持。研究希望 EPO 和 IL-4 的緩釋能夠發(fā)揮藥物的不同作用，以應(yīng)對(duì)急性腦損傷的不同階段。這種定時(shí)釋放水凝膠有望快速防止神經(jīng)元死亡和凋亡，調(diào)節(jié)慢性炎癥，并促進(jìn)損傷后血管生成，以最大限度地減少對(duì)大腦的繼發(fā)性損傷。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GC/I/E 水凝膠具有良好的神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)和促血管生成作用，能調(diào)節(jié) PI3K-Akt、MAPK、NF-kappa B、FoxO、多巴胺能突觸等信號(hào)通路，可減少星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成，促進(jìn)神經(jīng)和突觸生長(zhǎng)，改善受損血管功能，最終促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。該文章《Bioactive hydrogel synergizes neuroprotection, macrophage polarization, and angiogenesis to improve repair of traumatic brain injury》為題發(fā)表于《Materials Today Bio》（DOI：10.1016/j.mtbio.2024.101335）。

研究示意圖

（1）GC/I/E 水凝膠的化學(xué)構(gòu)建和表征

為了合成 GC 水凝膠，我們將甲基丙烯酸酸酐接枝到明膠和水溶性殼聚糖上，并使用自由基共價(jià)交聯(lián)水凝膠。如圖 1A 和 B 所示，1H NMR 結(jié)果驗(yàn)證了 GelMA 和 CSMA 的成功合成。甲基丙烯酸化后，GelMA 在 δ = 5.52 和 5.28 處觀(guān)察到新的吸收峰，CSMA 在 δ = 5.75 和 5.53 處觀(guān)察到新的吸收峰。這表明甲基丙烯酸部分的成功接枝。

TEM 圖像顯示 MSN 納米顆粒是球形的，粒徑均勻（圖 1C）。MSN 的 IL-4 包封率為 42.12 ± 8.6 %，8 天內(nèi)釋放率達(dá)到 80 %。隨后，通過(guò)調(diào)節(jié) CSMA 溶液的濃度制備了一系列不同濃度的 GelMA/CSMA 水凝膠，并研究了它們的流變學(xué)、機(jī)械溶脹和降解性能。CSMA 的摻入提高了交聯(lián)度并縮短了紫外線(xiàn)暴露時(shí)間 （10–30 s），從而保護(hù) EPO 和 IL-4 在紫外線(xiàn)照射下免受損失。通過(guò) SEM 觀(guān)察 GelMA/CSMA 水凝膠，如圖 1D 所示，GelMA/CSMA 水凝膠呈多孔互連結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)細(xì)胞浸潤(rùn)以及氧和營(yíng)養(yǎng)交換。通過(guò)流變學(xué)分析分析 GelMA/CSMA 水凝膠的粘彈性。GelMA/CSMA 水凝膠的儲(chǔ)能模量遠(yuǎn)高于損耗模量，并且在頻率和時(shí)間掃描中都保持穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)（圖 1E 和 F）。水凝膠的儲(chǔ)能模量隨著 CSMA 濃度的增加而增加。10 % GelMA/1 % CSMA 水凝膠的 G’ 范圍為 2.0–3.0 kPa，這也是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的 G’ 范圍。應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)表明，壓縮彈性模量隨著 CSMA 濃度的增加而變化，這表明 GelMA/CSMA 水凝膠具有可調(diào)節(jié)的機(jī)械強(qiáng)度（圖 1G）。

TBI 后，細(xì)胞代謝紊亂和炎癥因子釋放增加導(dǎo)致酸性代謝物積累和 pH 值降低。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后 TBI 后人腦的 pH 值持續(xù) 24 h 內(nèi)，嚴(yán)重 TBI 損傷病理環(huán)境的 pH 值可達(dá) 6.85 左右?；谶@些基礎(chǔ)，在 pH = 7.4 和 6.8 的 PBS 溶液中分別測(cè)量 GelMA/CSMA 水凝膠的溶脹率（圖 1H）。我們發(fā)現(xiàn)，水凝膠的溶脹速率隨著 CSMA 的加入而增加，這可能是由于殼聚糖大分子鏈中含有大量的親水基團(tuán)，如羥基和氨基，使其具有更好的吸水性。

圖1. 水凝膠系統(tǒng)材料的合成及 GelMA/CSMA 水凝膠的流變性、壓縮強(qiáng)度、體外溶脹和降解行為。(A) GelMA 的 ^1H NMR 譜圖。(B) CSMA 的 ^1H NMR 譜圖。(C) 介孔二氧化硅納米顆粒的 TEM 圖像。(D) 不同濃度水凝膠的 SEM 圖像，(E) 時(shí)間掃描序列，(F) 頻率掃描序列，(G) 應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)，(H) 溶脹曲線(xiàn)（每組 n = 3，pH = 7.4），(I) 無(wú)酶降解曲線(xiàn)和 (J) 含酶降解曲線(xiàn)（每組 n = 3）

（2）GC/I/E 水凝膠具有良好的生物相容性和神經(jīng)保護(hù)性能

GelMA 和 CSMA 是常見(jiàn)的水凝膠材料，具有良好的生物相容性，在體內(nèi)被酶和水解降解，可被細(xì)胞吸收并用作能量來(lái)源或參與細(xì)胞代謝過(guò)程。為了評(píng)價(jià) GC 水凝膠的生物相容性，通過(guò) CCK-8 和活/死細(xì)胞活力試劑盒評(píng)估水凝膠支架對(duì) HT22 細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的影響。如圖 2B 和 C 所示，與 HT22 細(xì)胞孵育 24 小時(shí)后，不同濃度的 GC 水凝膠提取物和 MSN 溶液的細(xì)胞活力高于 85 %。不同組間無(wú)顯著差異。細(xì)胞活力不隨 CSMA 濃度的增加而降低，低濃度劑量的 MSN 溶液不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。為了避免細(xì)胞毒性對(duì)腦組織的額外影響，我們最終選擇了 10 % GelMA/1 % CSMA 和 100 μg/mL MSN 濃度作為水凝膠支架進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。我們將水凝膠支架與 HT22 以確定的濃度比例共培養(yǎng) 3 天，并進(jìn)行活/死染色（圖 2A）?；?死染色圖像顯示，細(xì)胞密度隨孵育時(shí)間的增加而進(jìn)一步增加，活綠色細(xì)胞數(shù)量較高，死亡紅細(xì)胞僅偶發(fā)出現(xiàn)。與對(duì)照組相比，水凝膠支架不影響細(xì)胞活力，細(xì)胞增殖明顯。結(jié)果表明，水凝膠支架沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，可用于治療 TBI。GC/I/E 水凝膠旨在通過(guò) EPO 釋放防止 TBI 后的神經(jīng)損傷。如圖 2D 所示，HT22 與 250 μM H₂O₂ 共孵育 24 小時(shí)后，細(xì)胞活力降至 70.00 ± 2.68 %，GC/I 處理組保護(hù)率分別為 68.16 ± 1.52 %，GC/E 處理組為 71.84 ± 3.87 %，GC/I/E 處理組保護(hù)率最高（81.84 ± 2.90 %）。這證明了 GC/I/E 水凝膠具有一定的神經(jīng)保護(hù)能力。總體而言，GC/I/E 水凝膠具有良好的生物相容性和神經(jīng)保護(hù)性，可以提供基本的微環(huán)境來(lái)維持神經(jīng)細(xì)胞的存活和修復(fù)，因此是 TBI 治療的有前途的候選者。

（3）GC/I/E 水凝膠在體外調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向 M2 極化

將促炎性 M1 小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為修復(fù)性 M2 小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是抑制炎癥并有效促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)和組織修復(fù)的關(guān)鍵步驟。實(shí)驗(yàn)首先通過(guò) LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M1 極化，然后與治療組的水凝膠提取物孵育，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)研究巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物 CD86 （M1） 和 CD206 （M2） 的表達(dá)水平 （圖 2E）。如圖 2F 所示，統(tǒng)計(jì)分析顯示 LPS 組 CD86 的表達(dá)最高 （19.77 ± 0.13 %），這表明 LPS 成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M1 極化。GC/I/E 處理組水凝膠處理巨噬細(xì)胞中 CD86 表達(dá)的最低水平 （9.67 ± 2.20 %） 與所有其他組顯著不同。如圖 2G 所示，LPS 組的 CD206 表達(dá)最低 （9.29 ± 0.21 %）。在 GC/I/E 處理組中觀(guān)察到水凝膠處理的巨噬細(xì)胞中 CD206 表達(dá)水平最高 （22.17 ± 1.84 %）。GC/I 與 LPS 組 （14.80 ± 1.62%） 差異顯著。如圖 2H 所示，所有藥物治療組的 M1/M2 比值均降低，且均與 LPS 組差異顯著。GC/I/E 治療組 M1/M2 比值最低 （0.46 ± 0.13 %），這表明 GC/I/E 在促進(jìn) M1 表型向 M2 表型極化方面最有效。綜上所述，結(jié)果表明，在 IL-4 和 EPO 的共同作用下，GC/I/E 水凝膠在促進(jìn)巨噬細(xì)胞 M2 表型的極化方面具有有利作用，這可能減少 TBI 后的神經(jīng)炎癥，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

（4）GC/I/E 水凝膠在體外促進(jìn)血管生成

血管生成也是調(diào)節(jié) TBI 組織再生的關(guān)鍵因素。如圖 2I 所示，對(duì)照組在 4 小時(shí)后未觀(guān)察到血管生成，但已經(jīng)可以看到生長(zhǎng)成血管網(wǎng)絡(luò)的趨勢(shì)。GC 水凝膠治療組能夠形成一些血管網(wǎng)絡(luò)。在 GC/E 和 GC/I 水凝膠治療組中可以檢測(cè)到明顯的管腔形成。GC/E 水凝膠處理組的血管生成程度優(yōu)于 GC/I 水凝膠處理組。這意味著 EPO 和 IL-4 在體外都能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，但 IL-4 促進(jìn)血管生成的能力有限，EPO 的促血管生成作用大于 IL-4。在 GC/I/E 水凝膠治療組中可以發(fā)現(xiàn)大量的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和最長(zhǎng)管的形成。這表明在 EPO 和 IL-4 的協(xié)同作用下，GC/I/E 水凝膠處理組可以顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成作用。根據(jù)觀(guān)察結(jié)果，如圖 2J-M 所示，定量測(cè)量的統(tǒng)計(jì)分析表明，GC/I/E 水凝膠處理組的成管效果最好。處理組內(nèi)皮細(xì)胞的血管網(wǎng)絡(luò)數(shù)量、管形成和分支和管形成長(zhǎng)度顯著增加，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明，GC/I/E 水凝膠可能通過(guò)刺激宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞有效促進(jìn)新生血管形成。

圖2. GC/I/E 水凝膠的體外評(píng)估。(A) GC/MSN 提取物與 HT22 細(xì)胞共培養(yǎng) 3 天的活/死染色：AM（綠色），PI（紅色），比例尺 = 100 μm。(B) 不同濃度比 MSN 溶液共培養(yǎng) 24 小時(shí)后的細(xì)胞活力（n = 6），(C) 不同濃度比 GC 水凝膠提取物與 HT22 細(xì)胞共培養(yǎng) 24 小時(shí)后的細(xì)胞活力（n = 4）。(D) 各組水凝膠提取物在 250 μM H2O2 環(huán)境下與 HT22 細(xì)胞共培養(yǎng) 24 小時(shí)后的細(xì)胞活力圖（n = 5，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，????p ≤ 0.0001）。(E) 各組水凝膠處理 RAW264.7 細(xì)胞后 CD206 和 CD86 表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析（n = 3，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001）。(F) CD86 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，(G) CD206 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，(H) 各組基于流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的 M1/M2 比例定量分析（n = 3，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001）。(I) 各組水凝膠培養(yǎng) HUVEC 的體外管形成圖（n ≥ 6，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001，比例尺 = 200 μm）。對(duì)各組 HUVEC 進(jìn)行定量分析的結(jié)果包括 (J) 節(jié)段數(shù)量，(K) 管數(shù)量，(L) 節(jié)點(diǎn)數(shù)量，以及 (M) 總節(jié)段長(zhǎng)度（n ≥ 6，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001）

（5）GC/I/E 水凝膠降低低溫 TBI 后腦水腫的程度

據(jù)報(bào)道，低溫?fù)p傷模型 （CIM） 的病理特征與人類(lèi) TBI 的許多標(biāo)志性特征相同，并且在一定程度上可以模擬人類(lèi) TBI 的各種病理生理特征，如細(xì)胞損傷、血管損傷、炎癥免疫反應(yīng)、血腦屏障破壞和神經(jīng)功能障礙。CIM已被用于評(píng)價(jià)各種藥物對(duì) TBI 病理過(guò)程的治療效果，幫助研究人員確定腦損傷治療的時(shí)間窗，以及研究不同治療方法聯(lián)合使用的效果。在這里，研究了 GC/I/E 水凝膠在 CIM 中的治療效果。腦水腫是 TBI 的有害并發(fā)癥之一，腦水腫的嚴(yán)重程度被認(rèn)為與腦損傷的嚴(yán)重程度直接相關(guān)。研究使用 T2 加權(quán) MRI 估計(jì) TBI 后第 3 、 7 、 14 、 28 天的腦水腫。如圖 3A 所示，對(duì)照組在 7 d 損傷部位出現(xiàn)一個(gè)大的壞死腔，腦疝的程度隨著時(shí)間的推移而變得更加嚴(yán)重。可以看出，添加水凝膠可以支持細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)再生，并維持一定的顱內(nèi)壓。GC、GC/I、GC/E 和 GC/I/E 水凝膠處理組腦疝程度趨于降低，腔面積減少，這表明水凝膠治療促進(jìn)腦損傷的組織學(xué)修復(fù)。相比之下，GC/I/E 水凝膠處理組顯示腦疝程度最低，并且在 28 d 時(shí)腦組織學(xué)病變腔最小。Sham 組出現(xiàn)輕微的腦疝，這可能是由于 TBI 模型中切除了顱骨引起的。這些結(jié)果表明，GC/I/E 水凝膠可以減輕 TBI 后腦水腫，進(jìn)而減輕 TBI 后腦組織水腫引起的繼發(fā)性損傷。

（6）GC/I/E 水凝膠可防止神經(jīng)元損傷并促進(jìn)低溫 TBI 后腦組織重塑

28 d 的大腦一般圖像顯示，對(duì)照組可觀(guān)察到大空腔，并且有明顯的血瘀區(qū)域（圖 3B）。。通過(guò) H&E 染色進(jìn)一步研究了 TBI 組織的完整性以及 TBI 皮層中神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)變化（圖 3C）。相應(yīng)的 H&E 染色圖像（矢狀）也與圖 3B 中觀(guān)察到的圖像大致相同。對(duì)照組和 GC 水凝膠治療組的病灶腔到達(dá)白質(zhì)和海馬體，GC/I 、 GC/E 和 GC/I/E 水凝膠治療組小鼠對(duì)周?chē)M織的損傷明顯較小。GC/I/E 水凝膠處理組細(xì)胞浸潤(rùn)致密，無(wú)可見(jiàn)空泡組織。H&E 染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Sham 組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則。對(duì)照組和 GC 水凝膠治療組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞雜亂無(wú)章，形態(tài)不規(guī)則，可觀(guān)察到大量退化的嗜堿性壞死神經(jīng)元。在這些壞死細(xì)胞中沒(méi)有看到明顯的核仁，可能是由于核實(shí)變。GC/I 和 GC/E 水凝膠組壞死神經(jīng)元較少，而皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞排列雜亂無(wú)章。GC/I/E 水凝膠治療組神經(jīng)元壞死明顯改善，大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞排列更整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，腦結(jié)構(gòu)趨于正?；?。這表明 EPO 和 IL-4 協(xié)同作用非常好，并且 GC/I/E 水凝膠具有神經(jīng)保護(hù)作用并減輕神經(jīng)元壞死。

尼氏體染色是神經(jīng)元損傷的敏感指標(biāo)。在生理?xiàng)l件下，尼氏小體大而多，這反映出神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的效率更高。在神經(jīng)元損傷中，尼氏小體的數(shù)量會(huì)減少甚至消失。如圖 3D 所示，Sham 組中的 Nissl 體數(shù)量眾多且排列整齊。對(duì)照組皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)雜亂無(wú)章（神經(jīng)元細(xì)胞受損、碎片化或萎縮），Nissl 小體數(shù)量排列間距過(guò)大，可能存在大量神經(jīng)元缺失。GC 水凝膠治療組的 Nissl 囊泡結(jié)構(gòu)雜亂無(wú)章，可見(jiàn)神經(jīng)瘢痕形成，這會(huì)抑制腦組織的進(jìn)一步修復(fù)和再生。與對(duì)照組和 GC 組相比，其他水凝膠處理組退化神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量顯著減少，GC/I/E 水凝膠處理組的尼氏小體排列更整齊。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 GC/I/E 水凝膠的神經(jīng)保護(hù)和再生作用。

圖3. GC/I/E 水凝膠在冷凍損傷型創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）修復(fù)中的體內(nèi)評(píng)估。(A) T2 加權(quán) MRI 圖像。(B) 各組材料治療 28 天后的一般圖像，(C) H&E 染色圖像，(D) Nissl 染色圖像

（7）GC/I/E 水凝膠增強(qiáng)低溫TBI 后的抗炎作用

TBI 后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞密度往往與炎癥因子呈正相關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活增加了促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，這進(jìn)一步加劇了繼發(fā)性神經(jīng)元損傷，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕，阻止軸突生長(zhǎng)，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生受損。為了確定 GC/I/E 水凝膠的神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)能力，我們計(jì)算了 TBI 后第 3 天、第 7 天和第 28 天病灶周?chē)又行切文z質(zhì)細(xì)胞的密度，星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)志物。如圖 4A 所示，在 TBI 后的第 3 天和第 7 天，對(duì)照組和 GC 水凝膠處理組中的星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出肥大形態(tài)，這是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志。隨著治療時(shí)間的增加，兩個(gè)水凝膠治療組的 GFAP 比例均呈降低趨勢(shì)。創(chuàng)傷區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞的減少促進(jìn)了組織恢復(fù)，因?yàn)樗鼮榻M織再生和愈合過(guò)程提供了有利的環(huán)境。第 3 天和第 7 天，GC/I/E 水凝膠治療組在所有治療組中最低，表明 GC/I/E 水凝膠治療在減少神經(jīng)炎癥方面更有效，然而，每組 GFAP 的密度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。TBI 28 天后，對(duì)照組損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞密度百分比顯著升高 （0.92 ± 0.01 %） （圖 4E），并觀(guān)察到明顯的瘢痕形成。與對(duì)照組相比，GC 水凝膠處理組在 28 天 （0.64 ± 0.08%） 的星形膠質(zhì)細(xì)胞密度較低，并且可以觀(guān)察到較少的神經(jīng)瘢痕形成。GC/E 水凝膠處理組的星形膠質(zhì)細(xì)胞密度也顯示出降低的趨勢(shì) （0.59 ± 0.16 %），這表明 GC/E 水凝膠處理組的神經(jīng)炎癥得到改善。這可能歸因于EPO還具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化的能力，并且神經(jīng)保護(hù)藥物可以減少過(guò)度的氧化應(yīng)激和失調(diào)的能量代謝，延遲星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并緩解炎癥。GC/I 水凝膠治療組在 7 d 出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，28 d 時(shí) GC/I 中 GFAP 比例最低 （0.34 ± 0.17 %），表明 IL-4 的免疫調(diào)節(jié)作用可有效減少 TBI 誘導(dǎo)的慢性繼發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)炎癥，這與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 4D）。上述結(jié)果表明 GC/I/E 水凝膠的巨噬細(xì)胞 M2 極化和神經(jīng)保護(hù)作用可以減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少神經(jīng)炎癥，改善腦組織的炎癥微環(huán)境，從而促進(jìn)腦組織的修復(fù)。

（8）GC/I/E 水凝膠促進(jìn)低溫 TBI 后的神經(jīng)元增值

基于神經(jīng)保護(hù)和炎癥調(diào)節(jié)作用，我們預(yù)計(jì) TBI 后神經(jīng)元存活和再生會(huì)得到改善。因此，我們?cè)?TBI 后第 3 天、第 7 天和第 28 天觀(guān)察到神經(jīng)元特異性標(biāo)志物 NeuN 的免疫熒光染色。如圖 4B 所示，Sham 組沒(méi)有明顯的細(xì)胞死亡或神經(jīng)元丟失。3天NeuN 比例的統(tǒng)計(jì)分析（圖 4E）顯示，Sham 組與其他組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明 TBI 后神經(jīng)元嚴(yán)重丟失，但神經(jīng)元數(shù)量隨著水凝膠植入和藥物治療而增加。在 EPO 和 MSN@IL-4 聯(lián)合使用下，GC/I/E 水凝膠處理組的 NeuN 密度最高 （0.91 ± 0.02 %），并且與對(duì)照組 （0.36 ± 0.12 %） 顯著不同。這證明了神經(jīng)保護(hù)劑的保護(hù)作用。如 7d 所示，除假手術(shù)組和對(duì)照組外，所有組的 NeuN 密度均增加（圖 4F），表明神經(jīng)元再生的趨勢(shì)。在損傷修復(fù)的第 28 天（圖 4G），與 7d 相比，對(duì)照組和 GC 水凝膠治療組的 NeuN 密度降低，這與之前發(fā)現(xiàn)的 TBI 導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少和修復(fù)效果較差的發(fā)現(xiàn)一致。在 28 天時(shí)，觀(guān)察到 GC/I/E 水凝膠處理組的 NeuN 密度進(jìn)一步升高 （1.07 ± 0.04 %）。GC/E 水凝膠治療組 （0.74 ± 0.14 %） 的神經(jīng)再生優(yōu)于 GC/I 水凝膠治療組 （0.68 ± 0.11 %）（圖 4G）。這表明在用神經(jīng)保護(hù)劑及時(shí)保護(hù)后，神經(jīng)元再生更強(qiáng)。而M2極化巨噬細(xì)胞不僅能減少神經(jīng)炎癥，還能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，這與以往的研究一致。

突觸后密度 95 蛋白 （PSD95） 對(duì)突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性至關(guān)重要，有助于支持神經(jīng)發(fā)育和提高認(rèn)知能力。如圖 4C 所示，對(duì)照組顯示 PSD95 的表達(dá)最少 （1.48 ± 0.57 %），而 GC/I/E 水凝膠處理組 （6.38 ± 1.99 %） 的 PSD95 含量最高。與對(duì)照組相比，GC 水凝膠處理組 （3.00 ± 0.19%） 顯示 PSD95 水平顯著升高，GC/I 和 GC/E 水凝膠處理組表現(xiàn)出比單個(gè) GC 水凝膠處理組更高的表達(dá)，這與 NeuN 結(jié)果一致（圖 4H）。根據(jù)以前的研究結(jié)果，神經(jīng)保護(hù)和炎癥調(diào)節(jié)可以挽救突觸蛋白的丟失。

圖4. GC/I/E 水凝膠在改善炎癥微環(huán)境和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生中的評(píng)估。不同水凝膠處理腦組織的免疫熒光染色圖像：(A) GFAP（紅色），DAPI（藍(lán)色），比例尺 = 100 μm；(B) NeuN（綠色），DAPI（藍(lán)色），比例尺 = 100 μm；(C) PSD95（綠色），DAPI（藍(lán)色），比例尺 = 200 μm。(D) GFAP 在第28天的統(tǒng)計(jì)分析圖（n ≥ 3，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01）。NeuN 在（E）第3天、（F）第7天和（G）第28天的統(tǒng)計(jì)分析圖（n ≥ 3，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001）。(H) PSD95 在第28天的統(tǒng)計(jì)分析圖（n = 4）

（9）GC/I/E 水凝膠促進(jìn)低溫 TBI 后血管再生

我們通過(guò)觀(guān)察光聲成像拍攝的高分辨率血管圖像和通過(guò)散射流成像監(jiān)測(cè)腦血流 （CBF），評(píng)估 GC/I/E 對(duì) TBI 后腦血管結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的影響。如圖 5A 所示，我們使用高靈敏度光聲顯微成像在治療 28 天時(shí)獲得活體小鼠 TBI 的血管造影。影像學(xué)檢查顯示，對(duì)照組表現(xiàn)為局部腫脹、血管畸形，幾乎看不到微血管結(jié)構(gòu)。與 GC 和 GC/I 水凝膠處理組相比，GC/E 和 GC/I/E 水凝膠處理組的微血管結(jié)構(gòu)明顯增加，與 Sham 組的血管結(jié)構(gòu)接近。此外，我們分析了受傷血管的血紅蛋白濃度，如圖 5G 所示。TBI 后血紅蛋白濃度的降低 （12.53 ± 2.25%） 表明嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致受傷腦組織更加缺氧狀態(tài)。GC/E （33.78 ± 6.85 %） 和 GC/I/E （27.86 ± 2.05 %） 水凝膠處理組的血紅蛋白濃度均顯著高于各組。這表明 EPO 介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)和血管生成能力可以顯著改善 TBI 后的血管再生。如圖 5B 所示，每組均對(duì)損傷部位進(jìn)行散射血流成像。圖 5C、D 和 E 分別顯示了測(cè)試時(shí)的彩色、黑白和相應(yīng)的流動(dòng)成像圖。統(tǒng)計(jì)分析顯示 GC/E 和 GC/I/E 水凝膠治療組的血流量增加。與對(duì)照組相比，GC/I/E 治療組的血流速度增加了 36%（圖 5F）。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，TBI 后血管形成較弱，GC/I/E 水凝膠促進(jìn) TBI 后血管再生，改善 TBI 中明顯的缺氧和弱血流。

圖5. GC/I/E 水凝膠在冷凍損傷型創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）血管化修復(fù)中的評(píng)估。(A) 不同組在 TBI 治療 28 天后的光聲成像和 (B) 激光散射血流成像。(C) 彩色、(D) 黑白腦部圖片和 (E) 血流的激光散射成像圖；(F) 血流速度統(tǒng)計(jì)（n = 4）。(G) 血紅蛋白濃度統(tǒng)計(jì)（n ≥ 4，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，???p ≤ 0.001，????p ≤ 0.0001）

（10）GC/I/E 水凝膠增強(qiáng)神經(jīng)功能修復(fù)

改善繼發(fā)性 TBI 引起的神經(jīng)功能喪失具有臨床意義。我們根據(jù)時(shí)間線(xiàn)評(píng)估了 GC/I/E 水凝膠治療后神經(jīng)功能修復(fù)的水平，如圖 6A 所示。我們?cè)O(shè)計(jì)了 mNSS 行為實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試小鼠在運(yùn)動(dòng)、平衡、感覺(jué)和反射方面的神經(jīng)行為嚴(yán)重程度（圖 6B）。所有 TBI 組的 NSS 評(píng)分均升高，并隨著治療時(shí)間的增加而逐漸下降。第 7 天，GC/I 、 GC/E 和 GC/I/E 水凝膠處理組 NSS 評(píng)分顯著降低，GC/I/E 水凝膠處理組 NSS 評(píng)分最低，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明神經(jīng)保護(hù)、炎癥調(diào)節(jié)和血管生成改善了治療后小鼠神經(jīng)行為障礙的程度。小鼠新物體識(shí)別 （NOR） 測(cè)定顯示 （圖 6C） TBI 小鼠對(duì)新物體的探索減少，表明 TBI 損害了短期非空間記憶。進(jìn)行莫里斯水迷宮試驗(yàn)以評(píng)估 TBI 后小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。如圖 6D 所示，在受傷后 15 天訓(xùn)練開(kāi)始后 5 天內(nèi)，找到平臺(tái)的時(shí)間（逃逸潛伏期）逐漸減少。在學(xué)習(xí)后期，GC/I、GC/E 和 GC/I/E 水凝膠治療組的潛伏期明顯減少且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反映了 TBI 小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。其中，GC/I 水凝膠處理組的運(yùn)動(dòng)速度較低，可歸因于體內(nèi)血管再生較少和血管功能恢復(fù)較差（圖 5）。在測(cè)試當(dāng)天，分析了記憶檢索能力，我們分析了測(cè)試后對(duì)平臺(tái)區(qū)域的訪(fǎng)問(wèn)次數(shù)、在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間和游泳速度（圖 6E、F 和 G）。分析表明，GC/I/E 水凝膠處理組在移除平臺(tái)后測(cè)試得更好，顯示出與 Sham 組小鼠相當(dāng)?shù)挠洃浫萘?，這與平臺(tái)區(qū)域的訪(fǎng)問(wèn)次數(shù)圖表相對(duì)應(yīng)（圖 6H）。盡管如此，由于在治療后期小鼠個(gè)體水平之間的差距有點(diǎn)大，因此沒(méi)有觀(guān)察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜上所述，IL-4 對(duì)炎癥微環(huán)境的調(diào)節(jié)可進(jìn)一步影響神經(jīng)功能的改善，EPO 的神經(jīng)保護(hù)和血管再生作用可有效恢復(fù) TBI 后小鼠的行為科學(xué)。EPO 和 IL-4 的協(xié)同作用導(dǎo)致 GC/I/E 水凝膠的神經(jīng)功能恢復(fù)更加突出。研究結(jié)果表明，增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)、血管生成和免疫調(diào)節(jié)的策略可能為改善 TBI 后的功能提供有希望的機(jī)會(huì)。

（11）GC/I/E 水凝膠促進(jìn) TBI 修復(fù)機(jī)制的評(píng)估

 RNA 序列分析進(jìn)一步探討了 GC/I/E 水凝膠的 TBI 處理機(jī)制。如圖 7A 中的差異基因火山圖所示，與 TBI 組相比，GC/I/E 水凝膠處理組有 376 個(gè)富集的差異表達(dá)基因 （DEG） 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中包括 110 個(gè)上調(diào)基因和 266 個(gè)下調(diào)基因。為了探索 GC/I/E 水凝膠的功能特征和作用途徑，進(jìn)行了基因本體論 （GO） 分析和京都基因與基因組百科全書(shū) （KEGG） 分析。前 20 個(gè) GC 和 KEGG 基因富集氣泡圖中的大量基因與信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)活性、炎癥和突觸再生相關(guān)。富含 GO 的氣泡圖還顯示，治療與免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、程序性死亡和細(xì)胞因子活性相關(guān)（圖 7C）。研究選擇了與 TBI 治療相關(guān)的富含 KEGG 的氣泡圖（圖 7D）。在這些通路中，炎癥相關(guān)通路包括 MAPK 信號(hào)通路、NF-kappa B 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。細(xì)胞凋亡相關(guān)通路包括 PI3K-Akt 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等。血管生成相關(guān)通路包括 HIF-1 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路等。神經(jīng)發(fā)生相關(guān)途徑包括血清素能突觸、多巴胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、GABA 能突觸、膽堿能突觸等。GC/I/E 水凝膠處理顯著改變了與細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元存活、神經(jīng)元突觸生長(zhǎng)和神經(jīng)功能障礙相關(guān)的基因表達(dá)。例如，作為一種細(xì)胞表面蛋白，F(xiàn)as 可以與 Fas 配體 （FasL） 結(jié)合以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且在 TBI 后顯著增加。GC/I/E 水凝膠處理后基因表達(dá)降低，表明水凝膠抑制了細(xì)胞凋亡。參與小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化以及 M1 表型極化調(diào)節(jié)的炎性趨化因子 CCL2 （CC 趨化因子配體 2） 在 TBI 后顯著增加，是 TBI 后促進(jìn)炎癥的代表。GC/I/E 水凝膠處理后的減少表明水凝膠抑制炎癥。Bdkrb1（緩激肽受體 B1）是緩激肽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，可激活過(guò)多的促炎細(xì)胞因子并加劇焦慮樣行為，這種行為在 GC/I/E 水凝膠處理后顯著減少。補(bǔ)體蛋白 C3 的過(guò)表達(dá)會(huì)降低神經(jīng)突生長(zhǎng)和神經(jīng)元活力，促進(jìn)神經(jīng)元丟失，并限制體內(nèi)軸突再生。GC/I/E 水凝膠處理后 C3 基因表達(dá)顯著降低。Pla2g3（III 組分泌型磷脂酶 A2）可促進(jìn)神經(jīng)元突觸生長(zhǎng)并抑制神經(jīng)元死亡。Edn1 （Endothelin 1） 誘導(dǎo)血管生成途徑激活，參與TES 參與生物體的炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Tnr （Tenascin-R） 參與神經(jīng)元突觸生長(zhǎng)和神經(jīng)元細(xì)胞粘附、軸突導(dǎo)向、髓鞘形成和突觸可塑性。Tnr 缺乏會(huì)導(dǎo)致非進(jìn)行性神經(jīng)發(fā)育障礙。這些促進(jìn)神經(jīng)元存活和血管生成的基因在水凝膠處理后顯著增加。上述基因的調(diào)控驗(yàn)證了 EPO 和 IL-4 的功能，表明 GC/I/E 水凝膠對(duì) TBI 具有良好的治療效果。RNA 測(cè)序結(jié)果顯示，GC/I/E 水凝膠通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、凋亡、血管生成和神經(jīng)途徑預(yù)防神經(jīng)損傷，改善神經(jīng)炎癥環(huán)境，促進(jìn)血管、神經(jīng)元和突觸的再生以及神經(jīng)功能修復(fù)。

圖7. GC/I/E 水凝膠在調(diào)節(jié) TBI 治療中的機(jī)制。(A) 差異基因火山圖。(B) 篩選出的與神經(jīng)治療相關(guān)的差異基因熱圖（n = 3）。(C) GO 富集氣泡圖（n = 3）。(D) KEGG 富集氣泡圖（n = 3）

（12） GC/I/E 水凝膠在體內(nèi)具有優(yōu)異的生物相容性

研究通過(guò) H&E 染色進(jìn)一步審查了 GC/I/E 水凝膠的全身生物安全性（圖 8）。與 Sham 組相比，所有實(shí)驗(yàn)組小鼠主要器官均未觀(guān)察到明顯的組織損傷或形態(tài)變化，表明該制劑無(wú)顯著生物毒性。

圖8. 各水凝膠組的體內(nèi)生物相容性評(píng)估。治療 28 天后小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟的 H&E 染色圖像

研究小結(jié)：

本研究開(kāi)發(fā)了一種多功能水凝膠，并展示了其對(duì)腦損傷的治療應(yīng)用。我們使用甲基丙烯酸酐接枝明膠和殼聚糖作為水凝膠骨架，并加載 EPO 和 MSN@IL-4 （GC/I/E），它們?cè)谧⑸涞侥X損傷部位后交聯(lián)形成凝膠。水凝膠具有良好的生物相容性，能迅速發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境，同時(shí)促進(jìn)血管生成。經(jīng)體內(nèi)證實(shí)的低溫腦損傷模型，GC/I/E 水凝膠處理后，神經(jīng)元損傷減少，炎癥減少，神經(jīng)瘢痕形成減輕，神經(jīng)元再生和血管重塑得到有效促進(jìn)。GC/I/E 水凝膠可能為治療 TBI 提供新的臨床選擇。