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針對上述問題，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院先進(jìn)醫(yī)學(xué)研究院馮世青教授研究開發(fā)了一種溫度響應(yīng)性透明質(zhì)酸共軛水凝膠-聚多巴胺納米顆粒（PDA NPs）結(jié)合人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）移植（HPM水凝膠），PDA NPs修飾的水凝膠通過橋接神經(jīng)組織刺激干細(xì)胞的粘附和生長，減輕炎癥并促進(jìn) eNSPC 神經(jīng)元分化，協(xié)同促進(jìn)脊髓損傷后的神經(jīng)再生與功能恢復(fù)。用PDA NPs處理的小膠質(zhì)細(xì)胞可將細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低65%，并抑制炎性細(xì)胞因子如IL-1β（降低35%）和IL-6（降低23%）的表達(dá)，從而減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。此外，H-P-M水凝膠結(jié)合hMSCs移植可以將eNSPCs募集到損傷部位。RNA-seq揭示了H-P-M水凝膠通過MAPK通路促進(jìn)eNSPCs神經(jīng)元分化的潛力。該文章于2024年9月27日以《Synergistic restoration of spinal cord injury through hyaluronic acid conjugated hydrogel-polydopamine nanoparticles combined with human mesenchymal stem cell transplantation》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2024.09.027）。

圖1 用于 SCI 修復(fù)的多功能水凝膠支架的制備和使用示意圖

（1）PDA NP修飾水凝膠的制備和表征

PDA NP 摻雜水凝膠的制備過程如圖 2A 所示。HA-DA 通過引入多巴胺基團(tuán)增強(qiáng)粘附性能，其結(jié)構(gòu)經(jīng)¹H NMR（圖 2C）和 FTIR（圖 2D）驗證：HNMR 在 6.7 ppm 處出現(xiàn)新峰，F(xiàn)TIR 在 1730 cm?1處出現(xiàn)新的峰，表明多巴胺成功接枝。PDA NPs 呈球形，直徑 230 nm（圖 2B），通過與 HA-DA 混合并用 NaIO?交聯(lián)制備水凝膠（圖 2E）。SEM 顯示水凝膠具有均勻多孔網(wǎng)絡(luò)（圖 2F）。流變儀測試顯示，水凝膠在 1-500 s 內(nèi) G′和 G″穩(wěn)定，添加 PDA NPs 和 hMSCs 后，HA-DA 水凝膠 G′顯著增加至 370.3 ± 1.5 Pa，接近脊髓組織（圖 2G）。HA-DA 水凝膠對小鼠脊髓組織的粘附力顯著高于 HA 水凝膠（1.6 N 對 0.6 N，圖 2H）。

圖2 PDA NP修飾水凝膠的制備和特性。（A）熱敏PDA NP修飾的HA水凝膠的凝膠化示意圖；（B）PDA NP的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；（C）HA-DA的核磁氫譜（1H NMR）；（D）FTIR振動顯示了HA和HA-DA分子的吸收峰；（E）37°C下含或不含PDA NPs的HA-DA的凝膠化行為；（F）HA-DA水凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（白色箭頭表示PDA NPs的存在）；（G）HA-DA、H-P和H-P-M水凝膠的儲能模量（G'）和損耗模量（G''）；（H）水凝膠粘附到脊髓組織的直接視圖

（2）PDA NP 修飾水凝膠的生物相容性

流式細(xì)胞術(shù)顯示 hUC-MSCs 表達(dá) CD73、CD90 和 CD105 的陽性率分別為 99.93%、99.98% 和 99.98%，未檢測到造血干細(xì)胞標(biāo)志物 CD34 和 CD45（圖 3A）。hUC-MSCs 具有成骨、成脂和成軟骨的三系分化能力（圖 3B-D）。細(xì)胞增殖實驗表明，PDA NPs 濃度為 50 μg/ml 時對 hMSCs 有顯著細(xì)胞毒性（圖 3E）。Live/Dead 染色顯示 50 μg/ml 組活細(xì)胞減少，但未見顯著細(xì)胞死亡，表明高濃度 PDA NPs 抑制細(xì)胞增殖（圖 3F）。體內(nèi)實驗中，將載 hMSC 的 PDA NP 修飾水凝膠（H-P-M 水凝膠）注射到小鼠脊髓組織中，8 周后，肝腎功能血液檢查未發(fā)現(xiàn)功能受損指標(biāo)顯著升高（圖 3H），且主要器官未見病理變化（圖 3G），說明 H-P-M 水凝膠無體內(nèi)毒性。

圖3 PDA NPs的生物相容性和生物毒性。（A）通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定hUC-MSCs中CD34、CD45、CD73、CD90和CD105的表面標(biāo)志物；（B）茜素紅染色評估成骨分化能力；（C）油紅染色評估成脂分化能力；（D）阿爾新藍(lán)染色評估軟骨形成分化能力；（E）使用CCK8測定法評估不同濃度PDA NPs處理后1、3和7天hUC-MSCs的細(xì)胞活力；（F）用不同濃度的PDA NPs處理后1天和2天對hUC-MSCs進(jìn)行活/死染色，活細(xì)胞由鈣黃綠素染色（綠色）表示，死細(xì)胞由PI染色（紅色）表示；（G）小鼠水凝膠植入后8周心臟、腎臟、肝臟、脾臟和肺的H&E染色圖像；（H）小鼠H-P-M水凝膠植入后8周肝腎功能指標(biāo)（CERA/BUN/UA/ALP/ALT/AST）

（3）H-P-M 水凝膠促進(jìn)了 NSPCs 在體外分化為神經(jīng)元

為了驗證水凝膠清除 ROS 的能力，LPS 處理的 BV2 細(xì)胞在不同濃度 PDA NPs 下培養(yǎng) 24 小時后，細(xì)胞內(nèi) ROS 水平顯著降低：10、20 和 50 μg/ml PDA NP 處理分別降低 52%、65% 和 75%（圖 4A-B）。此外，20 μg/ml PDA NP 處理可使 BV2 細(xì)胞中炎癥因子 IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平分別降低 23% 和 35%（圖 4C-D）。結(jié)果表明，20 μg/ml PDA NPs 可有效清除細(xì)胞內(nèi) ROS 并降低促炎因子水平。進(jìn)一步實驗中，載 hMSC 的 PDA NP 修飾水凝膠（H-P-M 水凝膠）用于神經(jīng)球形成實驗。7 天后，共培養(yǎng)的原代 NSPC 和水凝膠負(fù)載的 hMSC 中，Tuj1 mRNA 和蛋白表達(dá)分別增加 2.71 倍和 1.03 倍，GFAP 降低 0.44 倍和 0.39 倍，MAP2 mRNA 表達(dá)增加 2.46 倍，表明神經(jīng)元分化增強(qiáng)（圖 4E-J）。

圖4 驗證H-P-M水凝膠在體外降低ROS并促進(jìn)NSPC神經(jīng)元分化。（A）LPS誘導(dǎo)的炎性BV2細(xì)胞中ROS的清除活性，用不同濃度（0 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml）的PDA NPs處理1天，ROS（綠色），DAPI（藍(lán)色）；（B）DCFH-DA檢測LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中的ROS水平；LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中（C）IL-1β（n = 3）和（D）IL-6（n = 3）的mRNA表達(dá)；（E）小鼠NSPCs和H-P-M水凝膠共培養(yǎng)示意圖；（F）與或不與H-P-M水凝膠共培養(yǎng)7天后Tuj1、MAP2和GFAP的mRNA表達(dá)；（G）NSPCs與或無H-P-M水凝膠共培養(yǎng)7天的GFAP和Tuj1表達(dá)的代表性圖像，比例尺：50 μm；（H）（G）的定量分析；（I和J）Western blot圖像顯示與或不與H-P-M水凝膠共培養(yǎng)7天的NSPC的GFAP和Tuj1的蛋白表達(dá)及定量分析

（4）H-P-M 水凝膠誘導(dǎo) SCI 后 5-HT 軸突再生并促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)

為了研究 H-P-M 水凝膠在體內(nèi)的治療效果，手術(shù)后立即將其注射到病變部位（圖 5A）。HE 染色顯示，H-P-M 水凝膠處理 8 周后病灶面積顯著減少（圖 5B），且該組表現(xiàn)出強(qiáng)健的 5-HT 軸突再生，而 SCI 組未觀察到（圖 5C）。動物行為和電生理學(xué)測試表明，H-P-M 水凝膠可顯著改善 SCI 小鼠的運(yùn)動功能恢復(fù)。BMS 評分和步態(tài)分析顯示，治療后 8 周，H-P-M 水凝膠組的 BMS 評分顯著高于 SCI 組（圖 5D）。MEP 記錄也證實，H-P-M 水凝膠組的 MEP 振幅顯著改善（圖 5E）。此外，足跡記錄分析顯示，H-P-M 水凝膠組的后肢運(yùn)動能力優(yōu)于 SCI 組（圖 5F）。這些結(jié)果表明，H-P-M 水凝膠可有效促進(jìn) SCI 后的運(yùn)動功能恢復(fù)。

圖5 H-P-M水凝膠誘導(dǎo)SCI小鼠5-HT軸突再生并促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)。（A）脊髓橫斷手術(shù)和水凝膠注射示意圖；（B）不同治療組HE染色脊髓切片的代表性圖像；（C）水凝膠注射后8周脊髓切片5-HT染色的代表性圖像；（D）SCI后不同治療組的BMS評分（Sham n = 8，SCI n = 8，HA n = 7，H-P n = 9，H-M n = 8，H-P-M n = 9）；（E）水凝膠注射后8周不同治療組MEPs的代表性圖像；（F）水凝膠注射后8周不同治療組足跡的代表性圖像

（5）在橫斷的 SCI 小鼠中，H-P-M 水凝膠表現(xiàn)出減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn) eNSPCs 分化為功能性神經(jīng)元的能力

為了研究 H-P-M 水凝膠對 eNSPCs 募集和分化的影響，使用 Nestin 譜系示蹤小鼠追蹤受傷脊髓中的 eNSPCs。結(jié)果顯示，86% 的 Ki67? eNSPCs 在 SCI 后被 tdTomato 標(biāo)記（圖 6D）。與 SCI 組相比，H-P-M 組在損傷中心觀察到更多 tdTomato? eNSPCs 積累，且損傷周圍區(qū)域的 eNSPCs（128.8 ± 6.83 個細(xì)胞/mm2）和 Ki67? eNSPCs（58.6 ± 8.14 個細(xì)胞/mm2）顯著增加（圖 6E-G），表明 H-P-M 水凝膠可有效募集 eNSPCs。GFAP、Tuj1 和 Syn1 染色顯示 tdTomato? eNSPCs 與神經(jīng)元標(biāo)志物 Tuj1 和突觸前標(biāo)志物 Syn1 共定位，表明募集的 eNSPCs 可分化為功能性神經(jīng)元并整合到神經(jīng)回路中（圖 6H-I）。RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，H-P-M 水凝膠處理組在傷后 7 天有 9160 個差異表達(dá)基因（DEGs），其中 5079 個上調(diào)，4081 個下調(diào)（圖 6A）。前 10 個上調(diào)的生物過程包括突觸組織、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸可塑性調(diào)節(jié)，表明神經(jīng)發(fā)生和突觸活性增強(qiáng)（圖 6A-B）。熱圖顯示神經(jīng)元標(biāo)志物（Tubb3、Map2、NeuN）、運(yùn)動神經(jīng)元標(biāo)志物（Chat）和突觸小泡標(biāo)志物（Syp、Snap25）顯著上調(diào)（|倍數(shù)變化|>5，p<0.05），進(jìn)一步證實神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元活性增強(qiáng)（圖 6C）。KEGG 富集分析表明，H-P-M 水凝膠通過正向調(diào)節(jié) MAPK 信號通路促進(jìn) eNSPCs 神經(jīng)元分化。H-P-M 組中 p-ERK 和 p-JNK 分別增加 2 倍和 3.1 倍（圖 6J）。

圖6 H-P-M水凝膠將eNSPCs募集到損傷部位并促進(jìn)神經(jīng)元分化以進(jìn)行SCI修復(fù)。（A）DEGs的結(jié)果（FDR < 0.05）由火山圖顯示；（B）展示了來自上調(diào)的DEGs的顯著富集的生物過程（BPs）；（C）參與神經(jīng)元分化（Tubb3、Map2、NeuN和Chat）和突觸形成（Syp和Snap25）的關(guān)鍵基因的熱圖；（D）代表性熒光圖像顯示SCI后Nestin譜系示蹤小鼠脊髓切片的Ki67染色，eNSPCs用tdTomato（紅色）標(biāo)記，每組中的細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記；（E）代表性熒光圖像顯示SCI小鼠病灶部位用tdTomato（紅色）標(biāo)記的eNSPC的募集，每組中的細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記；（F-G）在水凝膠注射后8周，對損傷部位周圍Nestin eNSPCs和Ki67以及Nestin增殖的eNSPCs進(jìn)行定量；（H）代表性熒光圖像顯示水凝膠注射后8周脊髓切片的Tuj1和GFAP染色，eNSPCs用tdTomato（紅色）標(biāo)記，每組中的細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記；（I）代表性熒光圖像顯示水凝膠注射后8周脊髓切片的Tuj1和Syn1染色，eNSPCs用tdTomato（紅色）標(biāo)記，每組中的細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記；（J）Western blot圖像和定量顯示JNK、ERK、p-JNK和p-ERK的蛋白表達(dá)

GO term 和 GSEA 顯示免疫細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子產(chǎn)生下調(diào)，特別是 iNOS、IL-1β 和 IL-6 的炎癥因子顯著下調(diào)（|倍數(shù)變化|>5 和 p < 0.05），表明 H-P-M 水凝膠注射后炎癥反應(yīng)減輕（圖 7A-C）。此外，IBA1 陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎因子 iNOS 降低了 39%，而抗炎因子 Arg1 增加了 79%，表明 H-P-M 水凝膠組的炎癥反應(yīng)減輕（圖 7D-E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，H-P-M 水凝膠通過 PDA NPs 的抗炎特性有效抑制原發(fā)性機(jī)械損傷后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，這有助于軸突再生和運(yùn)動功能恢復(fù)。

圖7 H-P-M水凝膠可減少SCI小鼠促炎因子的釋放和小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。（A）展示了來自下調(diào)的DEGs的顯著富集的生物過程（BPs）；（B）急性炎癥反應(yīng)基因集的GSEA分析；（C）參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵基因表達(dá)，包括iNOS、IL-1β和IL-6；（D）代表性熒光圖像和定量分析顯示水凝膠注射后1周每組脊髓切片的Arg1（紅色）和IBA1（綠色）染色，每組中的細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記；（E）代表性熒光圖像和定量分析顯示水凝膠注射后1周每組脊髓切片的iNOS（紅色）和IBA1（綠色）染色，每組中的細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記