針對上述問題，廈門理工大學(xué)李艷輝教授和吉林大學(xué)徐彩娜教授等人提出了開發(fā)一種多功能協(xié)同抗菌納米粒子（MPH NPs）的策略。該納米粒子通過將抗菌肽多粘菌素B（PMB）負(fù)載于Fe基MOF（MIL-100）上，并進(jìn)行透明質(zhì)酸（HA）修飾，實(shí)現(xiàn)了通過化學(xué)動力學(xué)治療（CDT）和PMB釋放的雙重抗菌效果。該文章于2024年6月10日以《Synergetic Antibacterial Nanoparticles with Broad-Spectrum for Wound Healing and Lung Infection Therapy》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202403188）。

MPH NPs的合成及抗菌應(yīng)用示意圖

（1）MPH NPs的合成與表征

MPH NPs的制備過程如圖1所示。首先，通過微波輔助法合成MIL-100NPs，并將PMB加載到MIL-100NPs中制備MP NPs，F(xiàn)T-IR和XPS結(jié)果顯示PMB成功負(fù)載（圖1A-F）。隨后，用HA修飾MP NPs，得到MPH NPs。通過控制MIL-100NPs與PMB的比例，優(yōu)化藥物負(fù)載量，最終選擇1:2的比例進(jìn)行研究（圖1G）。MPH NPs的粒徑約為203.4±5.1 nm，zeta電位約為-17.2±1.1 mV，表現(xiàn)出良好的分散性和穩(wěn)定性（圖1H-J）。在模擬細(xì)菌生長環(huán)境的研究中，MPH NPs在HA酶和酸性條件下表現(xiàn)出雙響應(yīng)釋放特性，釋放效率顯著提高（圖1K-L）。

圖1. MPH NPs 的表征。（A）MIL-100納米顆粒、PMB、MP納米顆粒、HA及MPH納米顆粒的FT-IR光譜；（B）MIL-100納米顆粒、MP納米顆粒及MPH納米顆粒的XPS光譜；（C）MPH納米顆粒的XPS分析：Fe 2p峰；（D）C 1s峰；（E）O 1s峰；（F）N 1s峰；（G）不同重量比MIL-100納米顆粒與PMB的MP納米顆粒的藥物加載量；（H）MIL-100納米顆粒、MP納米顆粒及不同MP納米顆粒與HA重量比的MPH1-3納米顆粒的粒徑；（I）MP納米顆粒與HA重量比為1:1時，MIL-100納米顆粒、MP納米顆粒及MPH納米顆粒的ζ電位；（J）MIL-100、MP納米顆粒及MPH1-3納米顆粒在ddH?O中24小時后的穩(wěn)定性圖像；（K）MPH納米顆粒在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4和5.5）和細(xì)胞培養(yǎng)基中的尺寸穩(wěn)定性（n=3）；（L）在有或無HAase的情況下，PMB在磷酸鹽緩沖液（pH 7.4或5.5）中的釋放情況（n=3）

（2）羥基自由基（?OH）的產(chǎn)生和谷胱甘肽（GSH）的消耗

MPH NPs能夠催化過氧化氫（H?O?）生成以?OH為主的活性氧（ROS），并通過電子順磁共振（EPR）譜圖驗(yàn)證其產(chǎn)生（圖2A）。通過3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色反應(yīng)和亞甲基藍(lán)（MB）降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了MPH NPs生成?OH的能力，且酸性環(huán)境（pH 5.5）下?OH的生成量顯著增加（圖2B-E）。此外，MPH NPs能夠消耗GSH（圖2F,G），降低細(xì)菌的抗氧化防御能力，從而增強(qiáng)抗菌效果。細(xì)胞內(nèi)ROS水平實(shí)驗(yàn)表明，MPH NPs在H?O?存在下能夠顯著增加RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了其產(chǎn)生ROS的能力（圖2H,I）。

圖2. MPH納米顆粒的ROS生成和GSH消耗能力。（A）MPH納米顆粒/H?O?體系中DMPO-?OH和DMPO-?O??的電子順磁共振（EPR）譜圖；（B）TMB顯色反應(yīng)結(jié)果；（C）MPH納米顆粒在不同pH值下產(chǎn)生?OH的催化能力；（D）不同濃度MPH納米顆粒降解亞甲藍(lán)（MB）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；（E）?OH生成速率與H?O?濃度之間的米氏-門特恩（Michaelis-Menten）曲線（pH 5.5，n=3）；（F）與不同濃度MPH納米顆粒孵育后GSH的消耗情況；（G）L929細(xì)胞經(jīng)不同濃度MPH納米顆粒處理后GSH的消耗情況；（H）RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)各組預(yù)處理12小時后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的熒光顯微鏡圖像；（I）細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計

（3）MPH NPs的體外抗菌試驗(yàn)

MPH NPs對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌S. aureus）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的抗菌效果通過細(xì)菌平板計數(shù)法進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，MPH NPs在H?O?存在下，通過CDT和PMB釋放的協(xié)同作用，對S. aureus和MRSA表現(xiàn)出顯著的抗菌效果，尤其在酸性環(huán)境（pH 5.5）下幾乎完全殺滅這些細(xì)菌。相比之下，單獨(dú)的PMB、MIL-100NPs或H?O?處理組的抗菌效果較差（圖3A-F）。

圖3. MPH納米顆粒的抗菌活性。（A）接種細(xì)菌的菌落照片（上圖：金黃色葡萄球菌；下圖：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA））；（B）相應(yīng)的細(xì)菌存活率；（C）不同條件下處理的金黃色葡萄球菌的熒光圖像；（D）不同條件下處理的MRSA的熒光圖像；（E）不同條件下處理的金黃色葡萄球菌的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（F）不同條件下處理的MRSA的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像

（4）MPH NPs在皮膚傷口感染中的抗菌效果

為了進(jìn)一步評估MPH NPs在傷口愈合中的抗菌效果，研究構(gòu)建了小鼠皮膚傷口感染模型（圖4A），并分別用含有PBS、PMB、MIL-100NPs和MPH NPs的Carbomer 940凝膠處理感染傷口。結(jié)果顯示（圖4B,C），MPH NPs治療組的小鼠傷口愈合速度顯著快于其他組，且細(xì)菌負(fù)載量最低（圖4F）。組織病理學(xué)分析表明（圖4E），MPH NPs處理組傷口的炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少，膠原沉積有序，血管生成和上皮結(jié)構(gòu)恢復(fù)良好。此外，MPH NPs處理組小鼠的體重變化也相對穩(wěn)定（圖4D），未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)。

圖4. 金黃色葡萄球菌對傷口愈合的治療作用。（A）傷口愈合模型治療方案示意圖；（B）第0、2、4、6、8天小鼠傷口區(qū)域的照片；（C）小鼠的相對傷口面積；（D）小鼠體重的相應(yīng)變化；（E）8天后各種治療后傷口組織的H&E和Masson染色圖像，箭頭指示膠原沉積和新生毛囊；（F）從傷口組織獲得的細(xì)菌菌落的照片及活細(xì)菌的定量分析

（5）MPH NPs的體外細(xì)胞攝取和體內(nèi)肺部靶向性

研究表明，MPH NPs能夠通過HA與細(xì)胞表面CD44受體的相互作用，實(shí)現(xiàn)特異性細(xì)胞攝取。在體外實(shí)驗(yàn)中，MPH NPs對表達(dá)CD44的RAW264.7細(xì)胞的攝取顯著高于不表達(dá)CD44的NIH3T3細(xì)胞（圖5A,B）。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，MPH NPs在肺部感染小鼠模型中，能夠特異性靶向感染部位，并在肺部長時間積累，有效發(fā)揮抗菌作用（圖5C-E）。

圖5. MPH納米顆粒的細(xì)胞攝取和靶向能力。（A）流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44陰性NIH 3T3細(xì)胞和CD44陽性RAW 264.7細(xì)胞對游離Cy5、Cy5標(biāo)記的MP納米顆粒、MPH納米顆粒以及HA+MPH納米顆粒的體外細(xì)胞攝??；（B）用PBS、游離RB、RB標(biāo)記的MP納米顆粒和MPH納米顆粒以及MPH納米顆粒+HA處理12小時的RAW 264.7細(xì)胞的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像；（C）肺部感染模型體內(nèi)藥物靶向?qū)嶒?yàn)方案；（D）不同時間點(diǎn)用游離Cy5、Cy5標(biāo)記的MP納米顆粒和MPH納米顆粒處理的肺部的活體成像系統(tǒng)（IVIS）圖像；（E）通過IVIS證實(shí)的肺中游離Cy5、Cy5標(biāo)記的MP納米顆粒和MPH納米顆粒的定量分析

（6）MPH NPs在肺部感染中的抗菌效果

在驗(yàn)證MPH NPs的體外抗菌效果和體內(nèi)肺部靶向性后，研究進(jìn)一步評估了MPH NPs在肺部感染模型中的治療效果。通過氣管內(nèi)注射S. aureus構(gòu)建小鼠肺部感染模型（圖6A），隨后分別注射PBS、PMB、MIL-100NPs和MPH NPs。結(jié)果顯示，MPH NPs治療組小鼠的肺組織損傷顯著減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，細(xì)菌負(fù)荷明顯降低，ROS生成增強(qiáng)（圖6B-F）。這表明MPH NPs在體內(nèi)肺部感染模型中也展現(xiàn)出有效的抗菌作用，促進(jìn)了肺部損傷的修復(fù)。

圖6. 對金黃色葡萄球菌肺部感染的治療效果。（A）PBS、PMB、MIL-100納米顆粒和MPH納米顆粒用于肺部感染治療的方案示意圖；（B）各種治療方法處理后的肺切片H&E染色的代表性圖像；（C）通過DHE熒光探針評估接受各種治療的小鼠肺中ROS的產(chǎn)生；（D）從受感染的肺組織中獲得的細(xì)菌菌落的照片；（E）受感染肺組織中活細(xì)菌的定量分析；（F）使用BCA試劑盒測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白質(zhì)含量