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針對上述問題，蘇州大學劉莊教授團隊聯(lián)合蘇州大學附屬第四醫(yī)院張曉峰教授團隊開發(fā)了一種基于過氧化氫酶（CAT）的新型眼藥水配方，通過殼聚糖（CS）和半胱氨酸（Cys）修飾形成CS-Cys/CAT納米復合物。該納米復合物能夠通過靜電相互作用自組裝，并與淚膜黏液層中的半胱氨酸形成二硫鍵，從而顯著延長CAT在眼表的保留時間，有效清除ROS，抑制炎癥和細胞損傷。實驗表明，CS-Cys/CAT眼藥水在干眼癥小鼠和兔子模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，且優(yōu)于臨床常用的環(huán)孢素和地塞米松。這種新型納米制劑具有良好的生物相容性，有望成為一種安全有效的干眼癥治療藥物。相關研究在2025年3月23日以“Eye-Drop Nano-Formulation of Catalase Self-Assembled with Thiolated Chitosan for Effective Treatment of Dry Eye Disease”為題發(fā)表于《Advanced materials》 （DOI: 10.1002/adma.202415353）上。

圖1. CS-Cys/CAT 納米復合物的合成與表征。（a）用于治療干眼癥的 CS-Cys/CAT 滴眼液示意圖；（b）合成的 CS-Cys 的游離巰基含量和取代度；（c）以 1:1 的重量比混合不同取代度的 CS-Cys 和過氧化氫酶制備的 CS-Cys/CAT 納米復合物的尺寸分布；（d）zeta 電位；（e）CS/CAT、CS-Cys（1）/CAT 和 CS-Cys（2）/CAT 的 TEM 成像，其中 CS-Cys（或 CS）與 CAT 的比例為 1:1；（f）CS/CAT 和 CS-Cys/CAT 納米復合物中過氧化氫酶的相對酶活性

（1）CS-Cys/CAT 納米復合物的合成與表征

該研究開發(fā)了一種基于過氧化氫酶（Catalase, CAT）的新型干眼癥治療藥物，通過殼聚糖（Chitosan, CS）和半胱氨酸（Cysteine, Cys）修飾形成CS-Cys/CAT納米復合物。CS-Cys通過酰胺反應合成，實驗制備了三種不同投料比（1:1、1:2、1:3）的CS-Cys樣品，其取代度分別為2.2%、4.2%和6.6%（圖1b）。通過核磁共振和傅里葉變換紅外光譜驗證了半胱氨酸的成功接枝。CS-Cys(1)和CS-Cys(2)與CAT以1:1的重量比混合，通過靜電和疏水相互作用自組裝形成納米復合物。動態(tài)激光光散射（DLS）結果顯示，CS-Cys(1)/CAT和CS-Cys(2)/CAT的平均粒徑分別為192 nm和223 nm，遠小于未修飾的CS/CAT（1565 nm，圖1c）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察顯示，CS-Cys/CAT具有均勻的球形結構，而CS/CAT結構松散且形狀不規(guī)則（圖1e）。此外，CS-Cys/CAT納米復合物在15天內保持穩(wěn)定，且在氮氣保護下可穩(wěn)定一個月。重要的是，與CAT的結合對過氧化氫酶活性影響甚微（圖1f）。

 （2）CS-Cys/CAT納米復合物的角膜前粘附和ROS清除能力

為了延長過氧化氫酶（CAT）在眼表的保留時間，研究者制備了不同比例的CS-Cys與CAT的納米復合物，并通過小鼠實驗篩選出最佳配方。實驗結果表明，CS-Cys(2)與CAT形成的納米復合物（CS-Cys(2)/Cy5.5-CAT）在角膜前段的保留能力最強（圖2a, b），推測是由于其更高的巰基密度。進一步優(yōu)化配方發(fā)現(xiàn)，當CS-Cys與CAT的重量比為1:1和2:1時，能夠形成均勻粒徑的納米顆粒（圖2c），并且CS-Cys/Cy5.5-CAT(1:1)在角膜表面的保留能力更強（圖2e, f）。因此，選擇CS-Cys:CAT重量比為1:1的配方用于后續(xù)研究。該配方的納米復合物在角膜表面的保留時間長達12小時（圖2g, h），且在干眼癥小鼠模型中也表現(xiàn)出良好的黏附效果。研究還通過實驗驗證了CS-Cys/CAT納米復合物與淚膜黏液層中豐富的半胱氨酸殘基之間形成的共價二硫鍵是其長期保留的關鍵（圖2i, j, k）。此外，CS-Cys/CAT納米復合物在人角膜上皮細胞中能夠有效抵抗高滲透壓培養(yǎng)基誘導的氧化應激。

圖2. CS-Cys/CAT納米復合物增強的角膜前滯留能力。（a）應用不同納米復合物2小時后小鼠眼球的共聚焦圖像；（b）利用ImageJ軟件對（a）中滯留在角膜表面的Cy5.5熒光強度進行半定量分析；（c）CS-Cys和過氧化氫酶的進料比不同，范圍從4:1到1:4（w/w），CS-Cys/CAT納米復合物的尺寸分布、PDI和zeta電位。這里使用的CS-Cys取代度為4.2%；（d）說明用于驗證局部滴眼劑施用CS-Cys/CAT納米復合物的角膜滯留效果的實驗程序；（e）應用不同進料比的CS-Cys/Cy5.5-CAT 2小時后小鼠角膜平裝標本的共聚焦圖像；（f）利用ImageJ軟件對（e）中小鼠角膜上殘留的Cy5.5熒光進行半定量分析；（g）應用CS-Cys/Cy5.5-CAT納米復合物后在不同時間點收集的角膜平裝標本的Cy5.5熒光的共聚焦圖像；（h）對（g）中Cy5.5熒光的半定量分析；（i）驗證CS-Cys/CAT納米粒子粘附于粘蛋白時二硫鍵形成的實驗裝置說明；（j）不同樣品中消耗的過氧化氫含量的百分比，反映了粘附于粘蛋白表面的CAT的量；（k）經(jīng)不同處理（含或不含DTT）的角膜平裝標本的Cy5.5熒光共聚焦圖像

（3）CS-Cys/CAT 滴眼液用于治療苯扎氯銨 (BAK) 誘發(fā)的 DED 小鼠模型

鑒于ROS在干眼癥（DED）發(fā)病機制中的重要作用，以及CS-Cys/CAT納米復合物增強的角膜黏附能力，研究人員測試了其對苯扎氯銨（BAK）誘導的干眼癥小鼠模型的治療效果。BAK能夠破壞角膜上皮細胞層的緊密連接，導致淚膜穩(wěn)定性受損、眼表炎癥和角膜上皮細胞損傷等干眼癥癥狀。實驗中，0.2% BAK眼藥水連續(xù)滴入小鼠眼表7天后，小鼠淚液分泌顯著減少，角膜熒光素鈉染色評分顯著增加，表明干眼癥模型成功建立。隨后，實驗人員將小鼠分為五組，分別給予PBS、CAT、CS-Cys、CS-Cys/CAT和環(huán)孢素眼藥水治療（圖3a）。結果顯示，CS-Cys/CAT眼藥水在愈合角膜上皮缺陷（圖3b, c）和恢復淚液分泌（圖3d）方面表現(xiàn)出色，優(yōu)于環(huán)孢素和其他對照組。組織形態(tài)學評估顯示，CS-Cys/CAT治療顯著改善了角膜結構和形態(tài)（圖3e），恢復了受損的角膜上皮細胞緊密連接。此外，CS-Cys/CAT眼藥水還顯著改善了淚腺的結構，使其接近健康狀態(tài)（圖3f），并顯著增加了結膜杯狀細胞的數(shù)量，恢復到健康小鼠的90%（圖3g）。這些結果表明，CS-Cys/CAT眼藥水不僅能夠清除ROS（圖3h, i），抑制細胞凋亡（圖3j, k），還能顯著降低角膜中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和MMP-9的水平（圖3l-o），從而通過多重機制有效治療干眼癥。

圖3. 局部施用CS-Cys/CAT治療小鼠模型中的BAK誘導干眼癥。（a）BAK誘導干眼癥模型的建立和治療實驗的設計示意圖。實驗組包括：i）PBS眼藥水，ii）CAT眼藥水，iii）CS-Cys眼藥水，iv）CS-Cys/CAT眼藥水和v）環(huán)孢菌素眼藥水；（b）代表性熒光素鈉染色圖像（用鈷藍濾光片拍攝時呈綠色）；（c）熒光素鈉染色的相應染色分數(shù)；（d）在整個七天的治療過程中用不同眼藥水治療的小鼠用濕潤的苯酚線長度測試的淚液量；（e）小鼠角膜的代表性H&E染色圖像；（f）淚腺的代表性H&E染色圖像。綠色箭頭：淚腺組織內淋巴細胞浸潤及結構紊亂；（g）結膜杯狀細胞PAS染色代表性圖像。紅色箭頭：杯狀細胞；（h）小鼠DED接受7天不同療法后角膜組織DCFH-DA染色代表性共聚焦圖像；（i）對（h）的半定量分析結果；（j）小鼠DED接受7天不同療法后角膜組織Tunel染色代表性共聚焦圖像；（k）對（j）的半定量分析結果；（l）通過對用不同眼藥水治療的小鼠的角膜上皮層進行免疫熒光染色來評估炎癥因子TNF-α、IL-1β和MMP-9；（m）通過ImageJ軟件對角膜上皮層中的TNF-α熒光強度進行半定量分析；（n）通過ImageJ軟件對角膜上皮層中的IL-1β熒光強度進行半定量分析；（o）通過ImageJ軟件對角膜上皮層中的MMP-9熒光強度進行半定量分析

（4）CS-Cys/CAT 滴眼液治療氫溴酸東莨菪堿 (SH) 誘發(fā)的 DED 小鼠模型

干眼癥（DED）病因多樣，臨床上分為蒸發(fā)過強型干眼和淚液缺乏型干眼。為了驗證CS-Cys/CAT納米復合物在淚液缺乏型干眼中的療效，研究人員建立了東莨菪堿（SH）誘導的小鼠干眼模型。東莨菪堿通過阻斷膽堿能受體抑制副交感神經(jīng)興奮，顯著減少淚液分泌，從而引發(fā)干眼癥狀。通過給小鼠皮下注射0.5 mg/0.2 mL的東莨菪堿溶液，每天四次，連續(xù)七天，成功建立了淚液缺乏型干眼模型。小鼠表現(xiàn)出典型的干眼癥狀，淚液分泌量從4.19±0.103 mm降至1.52±0.038 mm，角膜熒光素鈉染色評分從0.23±0.056升至2.67±0.119。隨后，研究人員將小鼠分組，采用與BAK模型相同的給藥方法進行治療（圖4a），并在第0、3、5、7天進行淚液分泌測試和眼科檢查。結果顯示，CS-Cys/CAT眼藥水在東莨菪堿誘導的干眼模型中表現(xiàn)出與BAK模型中相似的快速療效，能夠顯著促進受損角膜上皮的恢復（圖4b, c），并快速穩(wěn)定地增加淚液分泌（圖4d），效果優(yōu)于環(huán)孢素。治療過程中，所有治療組小鼠的眼內壓均保持在正常范圍內，表明這些眼藥水未對小鼠眼睛造成額外不良影響。治療結束后，研究人員對小鼠眼球和淚腺進行切片，進行ROS和TUNEL檢測（圖4e-h）。結果表明，與自由CAT、CS-Cys或環(huán)孢素相比，CS-Cys/CAT眼藥水顯著降低了角膜上皮細胞的氧化應激水平，并有效抑制了細胞凋亡（圖4i）。此外，CS-Cys/CAT處理的小鼠淚腺結構恢復最為顯著，腺泡大小均勻，排列整齊（圖4j）。這些結果表明，CS-Cys/CAT眼藥水在淚液缺乏型干眼模型中也表現(xiàn)出色，通過抑制眼表氧化應激和細胞凋亡，促進角膜上皮和淚腺的恢復，從而緩解干眼癥狀。

圖4. 局部施用CS-Cys/CAT治療小鼠模型中SH誘導的干眼癥。（a）SH誘導的干眼癥模型的建立和治療實驗的設計示意圖。實驗組包括：i）PBS眼藥水，ii）CAT眼藥水，iii）CS-Cys眼藥水，iv）CS-Cys/CAT眼藥水和v）環(huán)孢菌素眼藥水；（b）代表性熒光素鈉染色圖像（用鈷藍濾光片拍攝時呈綠色）；（c）熒光素鈉染色的相應分數(shù)；（d）在整個七天的治療過程中用不同眼藥水治療的小鼠用濕潤苯酚線長度測試的淚液量；（e）DCFH-DA染色的代表性共聚焦圖像；（f）對小鼠在接受七天的不同干眼癥（DED）治療后角膜組織的半定量分析；（g）小鼠接受DED七天不同療法后角膜組織的Tunel染色代表性共聚焦圖像；（h）對（g）的半定量分析；（i）小鼠接受DED七天不同療法后淚腺的Tunel染色代表性共聚焦圖像；（j）小鼠接受DED七天不同療法后淚腺的H&E染色圖像

（5）臨床劑量優(yōu)化及與藥物療效比較

為了優(yōu)化CS-Cys/CAT眼藥水的劑量并評估其療效，研究人員在BAK誘導的干眼癥小鼠模型中進行了實驗（圖5a）。小鼠每天兩次局部滴入不同濃度的CS-Cys/CAT眼藥水（1.5、0.5和0.15 mg/mL），所有樣品中CS-Cys與CAT的比例均為1:1。結果顯示，在治療的第2天，所有濃度的CS-Cys/CAT均能迅速恢復角膜表面，且三種濃度之間無顯著差異（圖5b, c）。到第7天，所有處理組的角膜熒光素鈉染色評分均恢復到健康水平，淚液分泌量也達到正常水平（圖5d）。這表明即使在很低的濃度（0.15 mg/mL）下，CS-Cys/CAT也能持續(xù)高效地清除ROS，顯示出抗氧化酶療法的獨特優(yōu)勢。此外，研究人員將CS-Cys/CAT眼藥水的療效與其他幾種臨床上使用的或處于臨床開發(fā)階段的干眼癥藥物進行了比較，包括全氟丁基戊烷+環(huán)孢素（SHR8028）、全氟己基辛烷（NOV03）、Reproxalap（ADX629）和地塞米松（圖5e）。結果顯示，在治療的第3天，CS-Cys/CAT眼藥水在促進受損角膜上皮恢復（圖5f, g）和淚液分泌增加（圖5h）方面均顯著優(yōu)于其他藥物，淚液分泌量在3天內從2.17±0.133 mm增加到4.28±0.501 mm。這些結果表明，CS-Cys/CAT眼藥水作為一種抗氧化酶療法，在治療干眼癥方面具有顯著優(yōu)勢，優(yōu)于現(xiàn)有的其他機制的藥物。

圖6. 局部使用CS-Cys/CAT治療阿托品誘發(fā)的兔干眼癥模型。（a）兔干眼癥模型建立及治療實驗設計示意圖。實驗組包括：i）PBS滴眼液，ii）CS-Cys/CAT滴眼液和iii）環(huán)孢菌素滴眼液；（b）代表性熒光素鈉染色圖像；（c）相應的染色評分；（d）在整個14天的治療過程中用不同療法治療的干眼癥（DED）兔子的淚液測試條測試的淚液量；（e）代表性健康兔子中央角膜的上皮細胞層、基質細胞層和內皮細胞層的體內角膜共聚焦顯微鏡圖像；（f–h）治療前后不同時間點家兔中央角膜上皮細胞層（f）、基質細胞層（g）和內皮細胞層（h）的代表性體內角膜共聚焦顯微鏡圖像。所有顯微照片的比例相同；（i）（f）中家兔中央角膜上皮細胞層每單位面積炎癥細胞數(shù)量的定量統(tǒng)計；炎癥細胞表示為小、圓、明亮的高反射細胞。請注意，在健康家兔的角膜上皮層中未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞（e）；（j）用不同滴眼液治療的家兔角膜組織TUNEL染色的代表性共聚焦圖像；（k）通過Image J軟件獲得的角膜上皮層TUNEL熒光半定量分析；（l）用不同滴眼液治療的兔子角膜組織DCFH-DA染色的代表性共聚焦圖像；（m）通過Image J軟件獲得的角膜上皮層DCFH-DA熒光半定量分析

（7）CS-Cys/CAT 滴眼液的安全性評估

為了評估CS-Cys/CAT眼藥水的安全性，研究人員在健康小鼠中進行了為期一個月的長期給藥實驗。小鼠每天兩次滴入PBS或CS-Cys/CAT眼藥水（5 μL/眼，CS-Cys：1.5 mg/mL，CAT：1.5 mg/mL）。在給藥期間，每3天測量一次小鼠的眼內壓（IOP）和體重，使用裂隙燈檢查角膜和角膜緣的狀態(tài)、角膜熒光素鈉染色和前房透明度，并在第7、14、21和28天使用光學相干斷層掃描（OCT）拍攝角膜厚度。實驗結束時，收集小鼠眼球和淚腺組織進行H&E染色。結果顯示，CS-Cys/CAT組和PBS組小鼠的角膜狀態(tài)無顯著差異（圖7a），且兩組小鼠的角膜熒光素鈉染色結果均為陰性，前房透明度高，表明CS-Cys/CAT眼藥水未引起顯著的眼部刺激。OCT成像進一步顯示，經(jīng)過4周的CS-Cys/CAT眼藥水給藥后，角膜厚度無顯著變化（圖7b, c）。此外，小鼠的體重和IOP值在整個給藥期間均保持在正常范圍內（圖7d, e），表明CS-Cys/CAT眼藥水的長期使用是安全的。視網(wǎng)膜的OCT成像結果也顯示，小鼠視網(wǎng)膜的厚度和結構與PBS組無顯著差異。眼底和熒光素眼底血管造影（FFA）成像結果也表明，CS-Cys/CAT眼藥水未引起眼底炎癥。H&E染色再次顯示，小鼠角膜完整，上皮細胞排列緊密，淚腺結構良好，腺泡大小均勻，排列整齊，形態(tài)正常（圖7f）。最后，為了評估CS-Cys/CAT眼藥水的潛在系統(tǒng)毒性，研究人員收集了小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟等主要器官進行H&E染色，并收集血液樣本進行血清生化分析。結果顯示，與PBS處理的小鼠相比，CS-Cys/CAT處理的小鼠主要器官切片未觀察到顯著變化，血液學分析結果也與PBS組無顯著差異。這些實驗結果表明，CS-Cys/CAT眼藥水具有優(yōu)異的生物相容性和安全性，局部對治療眼無毒性副作用，全身對機體也無毒性影響。

圖7. CS-Cys/CAT 納米復合物的安全性評估。（a）使用 i）寬光束照明、ii）熒光素染色和 iii）裂隙光束照明對 PBS 或 CS-Cys/CAT 眼藥水治療小鼠眼睛長達 28 天的代表性裂隙燈照片；（b）用 PBS 或 CS-Cys/CAT 眼藥水連續(xù)治療長達 28 天的小鼠角膜的代表性 OCT 圖像；（c）根據(jù) OCT 圖像對角膜厚度進行統(tǒng)計分析；（d）用 PBS 或 CS-Cys/CAT 眼藥水治療 30 天的小鼠的眼壓記錄；（e）用 PBS 或 CS-Cys/CAT 眼藥水治療 30 天的小鼠的體重記錄；（f）不同組小鼠眼睛和淚腺的代表性 H&E 染色切片